多肽藥物由于自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、穩(wěn)定性差、濃度低以及與雜質(zhì)結(jié)構(gòu)相類似,其分離純化是生產(chǎn)過程中最具挑戰(zhàn)性的一部分。傳統(tǒng)重結(jié)晶、精餾等有機(jī)小分子藥物純化方法不適用于多肽的分離純化,高效液相色譜具有極高的分離純化效率,且條件溫和,在分離純化過程中容易保持目標(biāo)分子的生物活性,成為多肽藥物分離純化的重要工具。
目前用于多肽藥物分離純化的層析或色譜技術(shù)主要是有三種:
一是離子交換色譜,由于多肽是由氨基酸通過酰胺鍵連接成的高分子物質(zhì),不同多肽分子帶的表面電 荷正負(fù)性質(zhì)及表面電荷數(shù)量都不同而且會隨著流動相的 pH 改變而改變,因此不同組份的多肽分子在離子層析介質(zhì)的電荷作用力有較大差異,通過改變水溶液的鹽濃度和 pH 來降低樣品組份與離子交換色譜填料的電荷作用力從而對不同多肽組份進(jìn)行洗脫分離。
二是反相色譜,多肽分子在極性較強(qiáng)的流動相如水的緩沖液中可以與色譜填料表面疏水基團(tuán)形成較強(qiáng)的疏水作用力而吸附在固定性表面上,然后通過降低流動相極性即增加流動相有機(jī)溶劑的比例如甲醇、乙腈等按極性強(qiáng)弱先后洗脫分離不同多肽樣品組分。
三是疏水作用色譜,與反相色譜相類似都是通過樣品組份帶有的疏水基團(tuán)與色譜填料表面基團(tuán)通過疏水作用力達(dá)到吸附的目的,然后通過調(diào)整流動相性質(zhì)來改變這種疏水作用力來達(dá)到分離的目的。
多肽分離純化色譜填料的選擇
理想的多肽藥物分離純化色譜填料必須滿足以下特性:
(a)高選擇性,高分離度;
(b)柱效高,分辨率高;
(c)載量大;單位體積填料處理多肽樣品的能力大
(d)化學(xué)性能穩(wěn)定,適用 pH 范圍寬(1-14);可在線清洗,耐臟性強(qiáng),使用壽命長;
(e)機(jī)械強(qiáng)度大,反壓低;易裝柱;
(f)產(chǎn)品重現(xiàn)性好,性價比高。
然而在現(xiàn)實中很難找到一款填料能滿足所有的要求,每種填料都有它自身的特性,選擇填料要綜合考慮成本,分離效率,產(chǎn)品純度,穩(wěn)定性等等。
目前用于多肽分析和分離純化的液相色譜填料主要基質(zhì)有三大類:
第一類是多孔二氧化硅(硅膠)為基質(zhì)的色譜填料;
第二類是天然碳水高分子改性填料包括改性纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等;
第三類是合成高分子色譜填料包括交聯(lián)聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等。
反相硅膠色譜已成為多肽分析和制備色譜的主流介質(zhì), 但硅膠表面的硅氧鍵耐堿性差使得這一填料不適合在堿性條件下分離和分析多肽分子和需要用堿性條件下再生的純化分離過程中。
天然碳水高分子改性填料由于親水強(qiáng),能減少對生物分子的非特異性吸附等特點因此在分離過程中容易保持生物分子的生物活性而被廣泛地用于生物大分子的分離純化。
交聯(lián)聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯由于機(jī)械強(qiáng)度好且合成聚合物微球的粒徑, 粒徑分布及孔道結(jié)構(gòu)容易控制,通過表面親水化改性后可以降低生物分子的非特異性吸附,而且克服了天然碳水高分子介質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度差,溶脹體積大的缺點,使生物分離純化更加快速、高效。因此合成高分子填料被越來越多地替代天然高分子改性填料用于多肽分子的分離純化。
用于多肽分析和分離純化的液相色譜填料主要基質(zhì)性質(zhì)對比
圖片來自納微科技
1)硅膠色譜填料
在高效液相色譜領(lǐng)域,二氧化硅 (硅膠) 及硅膠鍵合分離填料因具有良好的機(jī)械強(qiáng)度,耐溶劑性,孔道結(jié)構(gòu)及比表面積容易控制,優(yōu)異的耐熱性能,及表面富含易于鍵合或改性的硅羥基使得硅膠成為高效色譜填料應(yīng)用歷史最悠久也是應(yīng)用最為廣泛的高效液相色譜填料。
2)聚合物色譜填料
聚合物分離介質(zhì)因其良好的分離效果、穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)及高吸附載量,在多肽類藥物的分離與純化中得到越來越廣泛的應(yīng)用,也為多肽的分離介質(zhì)選擇提供了新的途徑。
3)聚合物和反相硅膠色譜填料的互補(bǔ)性能
硅膠和聚合物為基質(zhì)的填料是色譜分離和分析領(lǐng)域必不可少的兩種性能互為補(bǔ)充的色譜介質(zhì)。
硅膠基質(zhì)機(jī)械強(qiáng)度大、柱效高、分辨率好,已廣泛應(yīng)用于有機(jī)化合物及中性分子的分析和大規(guī)模制備生產(chǎn)中;而聚合物基質(zhì)填料則具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性及無與比擬的耐酸堿性,因此使用壽命長,可在線清洗適合生物分子的大規(guī)模純化分離。
色譜填料孔徑對多肽分離純化的影響
除了體積排阻色譜外,其它色譜分離機(jī)理都離不開樣品與色譜填料表面的作用。
色譜填料孔徑大小、分布及比表面積對多肽分離性能也有重大的影響。對于大多數(shù)分離模式來說有效的比表面積越大,載量越大,但有效比表面積取決于目標(biāo)樣品的分子量、孔徑大小及孔容積。
一般選擇有效比表面積越大的填料越好,這樣載量大,機(jī)械強(qiáng)度好。同時孔容積越大載量越大,分離效果也越好,但孔容積越大,機(jī)械強(qiáng)度越差。因此對于一般多肽分析和分離用色譜填料孔容積要求在 0.5-1.0 ml/g 左右,如果用于體積排阻利用分子篩性質(zhì)的填料孔容積要求會大于 1.3 ml/g。
填料粒徑大小及均一性對多肽分離純化的影響
色譜填料的粒徑主要影響填充柱的的柱效和背壓。填料粒徑越小,填充柱的柱效越高,在相同選擇性條件下,提高柱效可提高分離度。填料粒徑越小,柱壓也越高,因此對色譜系統(tǒng)的要求也越高,設(shè)備投資也越大,小粒徑色譜填料的價格也高。
選擇色譜粒徑大小要綜合考慮分離效率和成本。下圖是用納微科技 UniPS 系列不同粒徑聚合物色譜填料(粒徑分別為 10、20、30 微米)對多肽、蛋白等分離效果的影響。
不同粒徑的色譜填料對多肽和蛋白質(zhì)分離效果的對比
圖片來自納微科技
除了粒徑的大小外,色譜填料的粒徑分布情況也是色譜填料性能的重要參數(shù)。當(dāng)使用粒徑均一的微球填料填充色譜柱時,因其緊密程度一致,有效減少了填充床的多路徑效應(yīng),使溶質(zhì)分子流過色譜柱時經(jīng)歷的路徑長度基本相同,相應(yīng)的保留時間也較一致,使色譜峰寬變窄,理論塔板數(shù)升高,從而獲得較高的柱效(粒徑均一性對分離柱效的影響如圖 8 所示),在小分子及多肽的反相分離中獲得較好的分離效果。
粒徑均一性對分離柱效的影響
圖片來自納微科技
然而用于多肽藥物分離純化的色譜填料要求極高,世界上真正具備規(guī)?;a(chǎn)能滿足色譜需求的多分散多孔球形硅膠的廠家只有 Kromasil, Daisol,F(xiàn)uji 及 Merck 等四家。
而可以生產(chǎn)聚合物色譜填料的廠家主要有美國 GE,日本 Tosoh 等少數(shù)公司。目前大多數(shù)市場上的色譜填料無論是硅膠基質(zhì)還是聚合物基質(zhì)粒徑分布都較寬,因此開發(fā)單分散色譜填料的技術(shù)一直是業(yè)界的發(fā)展目標(biāo),也是該領(lǐng)域的技術(shù)難題。
納微科技已成功地開發(fā)出單分散多孔聚合物微球,成為世界第一家開發(fā)出單分散硅膠填料的大規(guī)模生產(chǎn)的企業(yè)。后續(xù)納微科技將繼續(xù)致力于研究單分散微球材料的制備和應(yīng)用,為單分散微球材料的發(fā)展貢獻(xiàn)自己的力量。