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RNA的制備
一、 mRNA的分離 與rRNA和tRNA不同的是，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的絕大部分mRNA在其3’端均有一poly(A)尾，因此可以用oligo(dT)－纖維素親和層析法從大量的細(xì)胞RNA中分離mRNA。在構(gòu)建cDNA文庫(kù)時(shí)， 必須經(jīng)上述純化步驟制備mRNA模板。進(jìn)行Northern雜交或Sl 核酸酶作用圖分析時(shí)，與總RNA相比，采用poly(A)+ RNA能獲得更為滿意的結(jié)果。 可以按照Gilham(1964)所述方法制備Oligo(dT)－纖維素，也可以買現(xiàn)成的產(chǎn)品。 1）用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g 0ligo(dT)－纖維素。 2）將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱或裝入填有經(jīng)用DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴期德吸管中， 柱床體積為0.5-1.0ml，用3倍柱床體積滅菌水沖洗柱床。柱床體積為1m的oligo(dT)－纖維素最大量為10mg總RNA，如果總RNA的量較少，則應(yīng)減少oligo(dT)－纖維素的使用量以防止poly(A)+RNA在過柱以及后續(xù)步驟中損失。 3）用無菌的1x層析柱加樣緩沖液沖洗柱床直至流出液的pH值小于8.0。1x層析柱加樣緩沖液 20mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 0.5mol/L NaCl 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.1％SDS 可按以下方法制備滅菌的層析柱加樣緩沖液；將適量無RNA酶的Tris. Cl(pH7.6)、氯化鈉和EDTA貯存液混合在15lbf/in2(1.034x105Pa)高壓下蒸氣滅菌，待其次序卻至65℃左右時(shí)加入已在65℃預(yù)熱30分鐘的10 ％SDS貯存液。也可以用0.05mol/L檸檬酸鈉代替Tris.Cl 然后用DEPC處理檸檬鈉－NaCL-EDTA和SDS的混合溶液。 4）用滅菌水溶解RNA，于65℃溫育5分鐘后使迅速冷卻至室溫，加等體積的2x層析柱加樣緩沖液，上樣，立即用滅菌的試管收集洗液。 當(dāng)所的RNA溶液均進(jìn)入柱床后，加1倍體積的1x層析柱加樣 ，繼續(xù)收集洗出液。加熱RNA可以破壞可能涉及poly(A)尾的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 5）當(dāng)全部溶液流出后，將收集液置于65℃溫育5分鐘，重新上樣，并收集流出液。 6）用5-10倍柱床體積的1x層析柱加樣緩沖液洗柱，分部收集洗出液，測(cè)定每一收集管的OD260。最補(bǔ)由于不帶poly)A)的RNA洗過柱床， OD260會(huì)很高，后來OD260值則很小或?yàn)榱?。在某些方案中，上述步驟后還用5倍柱術(shù)體積的含0.1mol/L NaCl的1x 層析柱加樣緩沖液洗柱床，然而由于洗出的不帶poly(A)的RNA很少甚至沒有， 因此這一步驟可以省略。 7）用2－3倍柱床體積的經(jīng)滅菌且無RNA酶的洗脫緩沖液洗脫mRNA，以1/3－1/2柱床體積分部收集洗脫液。洗脫緩沖液 10mmol/L Tris.Cl(pH7.6) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 0.05％SDS用于配制洗脫緩沖液的Tris. Cl 和EDTA貯存液應(yīng)為新近高壓的溶液 可用適量的滅菌水稀釋上述貯存液配制洗脫緩沖液。洗脫緩沖液不能高壓處理，因高壓會(huì)使溶產(chǎn)生大量氣泡。 8）收集液置于透明的小溶器內(nèi)，測(cè)定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時(shí)，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗合并含有RNA的洗脫組分。經(jīng)上述一輪oligo(dT)－纖維素親和量層析后得到的RNA中，帶與不帶poly(A)的RNA，其含量近乎相等。如欲進(jìn)一步純化mRNA，可將洗脫液于65 ℃溫育3分鐘，迅速冷卻至室溫，加入NaCl至終濃度為0.5mol/L，用同一oligo(dT)纖維素柱進(jìn)行第二輪層析。 9）收集oligo(dT)－纖維素柱層析的洗脫液，在mRNA溶液中加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終深度為0.3mol/L并混勻。加2.5 倍體積用冰預(yù)冷的乙醇，混勻，冰浴至少30分鐘。 10）于4℃以10 000g離心15分鐘回收poly(A)+RNA，小心棄去上清液，用70 ％乙醇洗滌沉淀（通?？床灰姵恋恚?，離心片刻，在空氣中晾干核酸沉淀。 11）用少量水重溶RNA，置于比色杯內(nèi)，測(cè)定OD260， 使用前比色杯須用濃鹽酸：甲醇（1：1）浸泡1小時(shí)，再用經(jīng)DEPC處理并高壓處理過的水徹底沖洗 12）將mRNA溶液由比色杯移至聚丙烯離心管內(nèi)，加3倍體積乙醇， 混勻，于－70℃保存?zhèn)溆谩；厥誖NA時(shí)，只需取出一小份貯存液，加3mol/K乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L， 混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。 注、1.OD260＝1的溶液其RNA含量約為40μg/ml。 2.從107個(gè)哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞中可獲得1－5μg mRNA，所得mRNA通常只占上柱的總RNA的1－2％。 3.現(xiàn)可直接從公司購(gòu)買純化試劑盒。 二、RNA酶活性的控制 為了獲得高質(zhì)量的真核細(xì)胞mRNA， 必須使用RNA酶的抑制劑或采用下述的破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法，最大限度地降低細(xì)胞破碎過程中所釋放的RNA酶的活性。同時(shí)，避免偶然引入實(shí)驗(yàn)室內(nèi)其他潛在的痕量RNA酶也很重要。下面列舉避免RNA酶法染問題的一些注意事項(xiàng)。大多數(shù)有經(jīng)驗(yàn)的研究者并不拘泥于這些注意事項(xiàng)，只是在遇到問題時(shí)可能采用其中的一種或幾種方法加以解決。 （一）實(shí)驗(yàn)程序 如不謹(jǐn)慎操作，外源性RNA酶可以通過下述途徑污染RNA制品： （１）玻璃制品、塑料制品和電泳槽 滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA〈, /SPAN〉酶，可以不經(jīng)預(yù)處理直接用于制備和貯存RNA。實(shí)驗(yàn)室用的普通玻璃器皿和塑料制品經(jīng)常有RNA酶法染，使用前必須于180℃干烤８小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間（玻璃器皿）或用氯仿沖洗（塑料制品）。另一種方法是用0.1 ％焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡用于制備RNA的燒杯，試管和其他用品。DEPC是RNA酶的強(qiáng)烈抑制劑，但其作用并不是絕對(duì)的。灌滿DEPC的玻璃或塑料器皿在37℃放置２小時(shí)，然后用滅菌水淋洗數(shù)次， 并于100℃干烤15分鐘。在15 lbf/in2(1.034x105Pa)高壓蒸氯滅菌15分鐘。上述處理可以除去器甲上痕量的DEPC，以防DEPC通過羧甲基化作用對(duì)RNA的嘌呤堿基進(jìn)行修飾。羧甲基化的RNA在無細(xì)胞體系中翻譯效率很低，然而，除非其中大部分嘌呤堿基均被修飾，否則其形成DNA：RNA或RNA：RNA雜交休的能力并不明顯降低。用于RNA電泳的電泳槽應(yīng)用去污劑洗干凈，再用水沖洗，用乙醇干燥，然后灌滿3％的H2O2溶液，于室溫放置10分鐘，然后用0.1 ％DEPC處理過的水徹底沖洗電泳槽。最好能留出一些玻璃器皿、塑料制品和電泳槽作上特殊標(biāo)記，存放在指定地點(diǎn)，為RNA實(shí)驗(yàn)專用。 （２）研究人員造成的污染 RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此，在準(zhǔn)備分離的和分析RNA的材料和溶液時(shí)，主有涉及RNA的一切操作過程中，都應(yīng)戴一次性手套，接觸“胖的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)勤換手套。 （３）污染的溶液 用高壓滅菌的水和RNA研究專用的化學(xué)試劑配制溶液，用干烤過的藥匙稱取試劑，將溶液裝入無RNA酶的玻璃器皿?？赡艿脑捜芤壕鶓?yīng)用0.1％DEPC于37℃至少處理12小時(shí)，然后于100℃加熱15分鐘或在15lbf/in2(1.034x105Pa)的高壓下蒸氣滅菌15分鐘。注：DEPC可與胺類迅速發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，因些不能用來處理含有Tris 一類的緩沖液。可存幾瓶新的未開封的Tris晶體以制備無RNA酶的溶液。 （二）RNA酶的抑制劑 下面介紹３種廣泛應(yīng)用的特異性RNA酶抑制劑。 （１）RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑是 從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)可與多種RNA酶緊密結(jié)合（KI≈3x1010）形成非共價(jià)結(jié)合的等摩爾復(fù)合物，使RNA酶失活。此蛋白質(zhì)體內(nèi)可能是血管生成素的抑制劑，血管生成素是氨基酸序列和推測(cè)的三級(jí)結(jié)構(gòu)與胰RNA酶類似的一種血管生成因子， 幾個(gè)廠家以不同的商品名出售這種抑制劑，該蛋白質(zhì)應(yīng)置于含5mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）的50％甘油中，貯存于－20℃。抑制劑制品凍融數(shù)次后或放置在氧化條件下即應(yīng)棄之不用，因?yàn)樯鲜鎏幚頃?huì)使蛋白質(zhì)變性從而釋放出所結(jié)合的RNA酶。因此，在使用變性劑裂解哺乳動(dòng)物細(xì)胞這一提取RNA的初始步聚中不應(yīng)使用這種蛋白抑制劑。然而職用更溫和的裂解方法時(shí)應(yīng)使用這種抑制劑，并且在后續(xù)的所有RNA純化步驟中均應(yīng)有此蛋白質(zhì)存在。由于酚抽提可以除蛋白質(zhì)抑制劑，故應(yīng)在純化過程中補(bǔ)加幾次抑制劑。其最大活性的發(fā)揮要求巰基試劑，而且它并不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯。 （２）氧釩核糖核苷復(fù)合物 這種由氧釩（1V）離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是量種過渡態(tài)類似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并幾科能百分之百地抑制RNA酶的活性。這４種氧釩核糖核苷復(fù)合物可加入完整細(xì)胞中，在RNA提取和純化的所有過程中，其使用濃度都是10mmol/L。所得到的mRNA可直接在硅卵母細(xì)胞中進(jìn)行翻譯， 并能作為某些外酶促反應(yīng)（如mRNA反轉(zhuǎn)錄）的模板。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物強(qiáng)烈抑制mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1％羥基喹淋的苯酚[ 用0. 01mol/LTris.Cl(pH7.8)平衡]多次抽提以去除之。有幾家公司出售氧釩核糖核苷復(fù)合物。 （３）Macaloid（硅藻上）Macaloid是一咱粘土，很多年前就發(fā)現(xiàn)它能吸附RNA酶，用緩沖液將其制成漿液，以0.015％（W/V）的終濃度溶解細(xì)胞。 這種粘土隨同它所吸附的RNA酶可在后續(xù)的RNA純化過程中（如酚抽提后）經(jīng)離心去除。 (三)破碎細(xì)胞和滅活RNA酶同步進(jìn)行的方法 用強(qiáng)烈變性如鹽酸胍或硫氰酸胍溶液能迅速溶解蛋白質(zhì)， 導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞而從核酸上解離下來。RNA酶可耐受多種處理等，因此可聯(lián)用上述試劑，從組織中，如富含RNA酶的胰腺中，提取完整無損的RNA。下述實(shí)驗(yàn)程序系列利用RNA酶抑制劑和（或）能迅速滅活RNA酶的有關(guān)方法從組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離總RNA、核內(nèi)RNA和胞質(zhì)內(nèi)RNA。這一從培養(yǎng)的單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離RNA的實(shí)驗(yàn)程序系為Favaloro 等（1980）所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或從易于分散成單個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA，因?yàn)橛眠@種裂解細(xì)胞的方法（在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化）去消化組織速度很慢，導(dǎo)致內(nèi)源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時(shí)間發(fā)揮作用。原方案中（Favaloro等。1980）采用的裂解緩沖液含有0.015 ％（W/V）的Macaloid（硅藻土），用于吸附并滅活RNA酶。盡管現(xiàn)仍有Macaloid出售NL Chemicals)， 但氧釩核糖核苷復(fù)合物和RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑更常用。下述程序的優(yōu)點(diǎn)是速度快，并能同時(shí)處理很多樣品。 A、細(xì)胞裂解 a．單層細(xì)胞的裂解 a)吸出培養(yǎng)液，以7ml用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細(xì)胞，重復(fù)1次，將平板置于冰上直至所有單層細(xì)胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上，再將鋁板置于冰盤上。 b)直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液， 并使之遍布整個(gè)平板的表面。 RNA提取緩沖注液 0.14mol/L NaCl 1.5mmol/L MgCl2 10mmol/L Tris.Cl(pH8.6) 0.5％NP-40 1mmol/L二硫蘇糖醇（DTT） 100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物 c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液，用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。 蛋白酶消化緩沖液 0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 0.3mol/L NaCl 2％ SDS d)用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3－4次，剪切DNA。 c)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。 蛋白酶K以貯存液的形式保存，貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。 b．懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解 a)于4℃以2000g離心5分鐘收集細(xì)胞，以10倍體積用冰預(yù)冷的無鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀，洗滌細(xì)胞3次，每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀，使其徹底分散。 b)估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積，用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。 c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液，用振蕩器迅速混勻。用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物，再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3－4次，剪切DNA。 d)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml，充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存，貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。B、提取步驟 1）用等體積酚：氯仿抽提1次，以去除蛋白質(zhì)。 2）用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相， 將水相吸至一個(gè)新的離心管內(nèi)，加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇，充分混勻， 于0℃放置1小時(shí)。 3）于0℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA，棄上清，用含0.1mol/L 乙酸鈉（pH5.2）的70％乙酸洗滌沉淀，用自動(dòng)微量移液器盡可能將乙醇吸盡， 隨后于室溫放置幾分鐘，晾干沉淀。切勿抽干沉淀，因?yàn)楦傻暮怂岢恋砗茈y溶解。 4）每個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿或每107細(xì)胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。 5）分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇（DTT），然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺(tái)盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復(fù)合物。 6）加入無RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml，混勻，于37℃溫育60分鐘。 7）分別按10mmol/L和0.2％的終濃度加EDTA和SDS。 8）用等體積酚：氯仿抽提1次。 9）于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相， 將水相吸至另一個(gè)離心管內(nèi)，加3mol/L乙酸鈉（pH5.2）至終濃度為0.3mol/L，加2.5倍體積用冰預(yù)次的乙醇，充分混勻，冰浴放置2小時(shí)。 10）用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。 11）吸出所有的乙醇，將打開管蓋的離心管在實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置幾分鐘，讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。 12）用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加500μl乙醇，于－70 ℃貯存?zhèn)溆谩；厥誅NA時(shí)，只須取出1小份貯存液，加入3mol/L乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L，充分混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。 C、注意事項(xiàng) 1．測(cè)定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液離心沉淀RNA，以400水重溶， 測(cè)定OD260 值， OD260＝1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。 2.如果需要，可用oligo(dT) －纖維素層析法從所制備的細(xì)胞總RNA中純化無寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購(gòu)買試劑盒進(jìn)行mRNA的純化。 3.某些情況下（例如從感染了DNA病毒或用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備RNA時(shí)），必須從細(xì)胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則，當(dāng)用這種RNA構(gòu)建cDNA庫(kù)或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時(shí)應(yīng)會(huì)出問題， 反轉(zhuǎn)錄過程中法染的模板DNA片段可能會(huì)與RNA雜交而充當(dāng)引物，從而導(dǎo)致物定mRNA5’末端定位的錯(cuò)誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。 a)步驟12后，加200μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），用自動(dòng)微量移液器反復(fù)吹吸，以重懸核酸沉淀，將懸浮液移至另一個(gè)滅菌的微量離心管內(nèi)。 b)用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分鐘，RNA沉于管底，而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。 c)棄上清液，用200μl TE（pH7.6）重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉（pH5.2），分混勻，加入550μl用冰預(yù)冷的乙醇?；靹蛉芤?， 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離主10分鐘，以回收RNA。小心吸出上清。d)棄上清液，用300μl TE（pH7.6）重溶沉淀，加1ml乙醇，－70℃貯存?zhèn)溆谩?回收RNA時(shí)，只需取出1小份貯存液，加3mol乙酸鈉（pH5.2 ）至終濃度為0.3mol/L充分混勻，用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復(fù)合物，用含0.1％羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數(shù)次即可。 4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞株來說， 一個(gè)直徑90mm 培養(yǎng)甲中培養(yǎng)的RNA收率為100-200μg。用異硫氰酸胍和有機(jī)溶劑提?。遥危? 收集細(xì)胞，離心5000r/min ，5分鐘，棄上清，加入異硫氰酸胍變性液（異硫氰酸胍4mol/L；檸檬酸鈉25mmol/L，Sarkosy10.5%,β-巰基乙醇0.1mol/L）500ml，混勻，振蕩10秒，加2 mol/L醋酸鈉50ml，水飽和酚500m l和氯仿/異戊醇（49：1）100m l顛倒混合數(shù)秒鐘，冰浴15分鐘，4℃離心10,000 r/min，15分鐘，吸取上清，加入等體積異丙醇或2倍體積無水乙醇，, 4℃離心10,000 r/min，10分鐘，棄上清，70%酒精洗滌一次，抽干，加35mlDEPC處理水溶解，取5ml經(jīng)稀釋后紫外測(cè)定RNA提取量，其余30ml分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>
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